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HPLC
Um sicherzustellen, dass Säule und System einwandfrei funktionieren, z.B. nach dem Einbau einer neuen Säule oder nach einer Geräte-Wartung, kann mit chromatographischen Standards das gesamte LC-System (oder LC-MS System) getestet werden. Die universellen Standards liefern sehr einfache Chromatogramme, die als Referenz gesetzt werden können. Zu bestimmten Zeitpunkten, beispielsweise täglich vor Laufbeginn oder 1-2 mal pro Woche, wird der Marker gefahren und gegen das Referenzchromatogramm abgeglichen. Eventuelle Abweichungen können auf Fehler und deren Ursachen hinweisen, ohne dass Sie wertvolle Proben verlieren. Die Richtigkeit Ihrer Resultate ist damit auf Systemebene gewährleistet. Bei Abweichungen erhalten Sie Hinweise, wo der Fehler im System zu finden ist. Die LC-Referenzmaterialen helfen Ihnen dabei, das Vertrauen und die Sicherheit in die Analysenergebnisse zu stärken.
Die HPLC-Technologie ermöglicht das Arbeiten mit flüssigen oder festen, beziehungsweise nicht flüchtigen Substanzen, die beispielsweise mittels Gaschromatographie nicht analysiert werden können.
Anwendung von HPLC-Standards: Methodik
Die Methodik beruht auf einem Pumpsystem, das das zu analysierende Substanzgemisch durch eine HPLC-Säule leitet. Nach einem zeitlich unterschiedlichen Austritt der einzelnen Komponenten aus der Säule werden diese durch bestimmte Detektoren erfasst und in einem Zeit/Intensitäts-Chromatogramm dargestellt.
Das Substanzgemisch wird in einem passenden Fließmittel, der mobilen Phase, durch das System transportiert. Die Fließmittel werden auch als Eluenten oder Elutionsmittel bezeichnet. Das Säulenmaterial ist fest verankert und dient als stationäre Phase. Das Trennprinzip beruht auf unterschiedlich starken Wechselwirkungen zwischen der Probe und der stationären Phase. Kommt es zu starken Wechselwirkungen, verweilt eine Substanz relativ lange in der Säule und wird später detektiert als solche Substanzen die nur weniger stark mit der stationären Phase wechselwirken.
Die zwei gängigsten Trennmodi in der HPLC ist die Normalphasen-HPLC (NP-HPLC) und die Reversed Phase HPLC (RP-HPLC), die sich im Aufbau der stationären und mobilen Phase unterscheiden: Bei der NP-HPLC wird eine polares Säulenmaterial genutzt. Je polarer die Substanz ist, desto länger verweilt die Substanz auf der Säule. Deutlich häufiger wird die RP-HPLC-Methode angewandt. Hier wird das Kieselgel durch Alkylgruppen so modifiziert, dass es unpolar wird. Als mobile Phase dienen bei der RP-HPLC meist Mischungen aus Wasser, Acetonitril, Methanol und eventuell Puffer.
Um Stoffgemische zu charakterisieren sind Vergleichsreagenzien notwendig. Diese werden mit der mobilen Phase injiziert und ergeben ihrer Konzentration und Beschaffenheit entsprechend Signale. Diese können dann mit den Signalen der zu analysierenden Substanzen verglichen werden. Hierbei ist die Intensität und die Peakfläche ein Indikator für die Konzentration und die sogenannte Retentionszeit ein Anhaltspunkt für den chemischen Aufbau der Substanz. Unter der Retentionszeit versteht man den Austrittszeitpunkt der Substanz aus der Säule nach Injektion.
Die gängigsten Säulen haben eine Länge zwischen 20 und 300mm und einen Innendurchmesser von 2-4,6 mm. Um diese Säulen zu schützen, werden häufig Vorsäulen eingesetzt, die Verunreinigungen von der deutlich teureren Hauptsäule fernhalten.
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